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澳门太阳集团城网址:样本制备方法之蛋白提取的总原则及注意事项点击次数:66 发布时间:2020-11-17

      样本制备是实验的步骤,也是决定实验成败的关键步骤,获得的蛋白质样品必须均质、可溶,并解离成单个多肽亚基,且尽量减少相互间的聚集,使其仅依赖本身的分子量大小进行分离。常见的样本来源有重组蛋白、细胞和组织等。

 蛋白提取的总原则和注意事项:

    1.尽可能提取完全或降低样本复杂度,只集中提取目的蛋白;

    2.保持蛋白处于溶解状态(通过裂解液的pH盐浓度,表面活性剂,还原剂等的选择);

    3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等(低温操作,加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂);

    4.尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略);

    5.样品分装,长期于-80℃保存,避免反复冻融。

    细胞裂解:

    1.培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次,裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂;

    2.吸尽PBS,加入预冷的裂解液(1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask);

    3.用细胞刮子刮取贴壁细胞,将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中;

    4.4℃摇动30mins;

    5.4℃,12000rpm离心20mins;

    6.轻轻吸取上清,转移至新预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀。

    组织裂解:

    1.用灭菌的预冷的工具分离目的组织,尽量置于冰上以防蛋白酶水解;

    2.将组织放在圆底微量离心管或EP管中,加入液氮冻结组织于冰上匀质研磨,长期可保存于-80℃;

    3.每5mg加入约300ul预冷的裂解液,冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时,裂解液体积与组织样本量有适当比例(蛋白浓度至少达0.1mg/ml,理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml);

    4.4℃,12000rpm离心20mins,轻轻吸取上清,转移至新预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀。

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